Versuchsdurchführung

  • die bereitgestellte Hefesuspension wird mit 12,5 g Glukose gefüttert
  • anschließend 15 min vorinkubiert
  • als aerobes Reaktionsgefäß dient ein 100 ml Erlenmeyerkolben
  • als anaerobes Reaktionsgefäß dient eine 100 ml Spritze

Es wird in beide Raktionsgefäße 50ml repräsentative Zellsuspension gegeben und vorinkubiert. Die Spritze besitzt einen Schlauch zur Entlüftung und einen zum Entnehmen von Proben.

  1. im Abstand von 20 min werden aus beiden Ansätzen jeweils 2 Eppendorf-Röhrchen (2 ml) Probe entnommen
  2. die Proben werden bei 12000 \( U*min^{-1} \) für 5 min zentrifugiert
  3. die Überstände werden überführt und bei 90 °C im Thermoblock für 10 min erhitzt
  4. die gesammelten und abgekühlten Proben werden nochmals bei 12000 \( U*min^{-1} \) für 10 min zentrifugiert
  5. messen des Drehwinkels im Polarimeter bei 365nm - die erste Probe dient zum Spülen, die zweite als Messlösung

Messwerte

anaerober Versuchsansatz

Zeit [min] Drehwinkel [°] M [mM] M [mM] n [mmol/g Hefe] n [pro h]
80 7,15 238,33      
100 -- -- -- -- --
120 7,78 259,33 +21 +2,10 +6,30
140 7,61 253,67 -5,66 -0,57 -1,70

aerober Versuchsansatz

Zeit [min] Drehwinkel [°] M [mM] M [mM] n [mmol/g Hefe] n [pro h]
80 7,23 241,00      
100 -- -- -- -- --
120 7,57 252,33 +11,33 +1,13 +3,40
140 7,39 246,33 -6 -0,60 -1,80

Zur Bestimmung der Glukosekonzentration im Polarimeter wird eine Standardlösung der Konzentration 10mM und einem Drehwinkel von 0,3° als Bezugspunkt verwendet. Die Konzentration berechnet sich dann wie folgt: \[ c = \frac{\text{Drehwinkel} * 10 \text{mM}}{0,3 \text{°}} \]

Zur Herstellung der Hefesuspension wurden 2,5g Hefe in insgesamt 250ml Medium kultiviert. Unter der Annahme, dass die Hefe sich seit der Kultivierung nicht vermehrt hat, befinden sich in einer repräsentativen Probe von 50ml 0,5g Hefe. Zum Berechnen der Stoffmengenänderung aus der Konzentration wurde folgende Formel benutzt: \[ n (\text{Glc}) = \Delta M[\text{Glc}] * \frac{V}{0,5 g} \]

Auswertung

theoretische Überlegungen

  1. Summenformel der Atmung: \[ C_6H_{12}O_6 + 6 O_2 \rightarrow 6 CO_2 + 6 H_2O + 30 ATP \]
  2. Summenformel ethanolische Gärung: \[ C_6H_{12}O_6 \rightarrow 2 C_2H_5OH + 2 CO_2 + 2 ATP \]
  3. der Gewichtsverlust bei der mitochondrialen Atmung beträgt 72g pro Mol Glukose und 88g pro Mol Glukose bei der ethanolischen Gärung

Vergleich der Versuchsansätze

Durch einen Fehler bei der Versuchsdurchführung und Schwierigkeiten mit dem Polarimeter mussten die Proben für \( t=100 \) verworfen werden, so dass nur Messwerte für \( t=120 \) und \(t=140 \) zur Auswertung herangezogen werden können.
Die Messung des Polarisationswinkels bei \( t=120 \) hat ergeben, dass die Glukosekonzentration im Vergleich zum Messwert \( t=80 \) angestiegen ist, was eindeutig auf einen gravierenden Fehler hinweist. Es ist möglich, dass das Polarimeter von uns anders verwendet wurde, als es die Gruppe vor uns für den Messwert \( t=80 \) getan hat. Allgemein lässt sich aber festhalten, dass das Polarimeter die größte Fehlerquelle darstellt, womöglich auch kaputt gewesen sein könnte. So hing die Mechanik vom Zählwerk öfters fest, so dass sich womöglich nicht der wirkliche Messwert einstellte.Durch das hohe Alter des Gerätes kann auch von weiteren Verschleißerscheinungen ausgegangen werden.
Der Sauerstoffverbrauch der Hefe im Durchflussexperiment beträgt: \[ \dot{n}_{O_2} = -0,549 \frac{mmol}{h*g} \]

Über die Summenformel der Atmung lässt sich der Glukoseverbrauch durch reine Atmung berechnen, dieser beträgt: \[ \dot{n}_{\text{Glc}}= \frac{1}{6} * \dot{n}_{O_2} = \mathbf{-91 \frac{\mu mol}{h*g}} \]

Wenn man nun den Glukoseverbrauch durch die Atmung vom bestimmten Glukoseverbrauch im aeroben Gärungsversuchen abzieht, erhält man den Wert für die reine aerobe Gärung: \[ \dot{n}_{\text{Glc}}= \mathbf{-1,71 \frac{mmol}{h*g}} \]

Das Verhältnis von aerober Gärung zur Atmung beträgt 19 : 1. Das lässt erkennen, dass die Hefe auch unter aeroben Bedingungen größtenteils Gärung betreibt. Wenn man uns dieser Erkenntnis eine Vorhersage zum Pasteureffekt machen soll, wird vermutet, dass dieser sehr gering ausfällt, da bei aeroben Bedingungen nur sehr wenig Atmung betrieben wird und somit der Glukoseverbrauch kaum abnimmt. Dies ist ein gewünschter Effekt, der durch die Züchtung der Bäckerhefe verstärkt wurde. Wichtige Voraussetzung der anaeroben Gärung ist das Vorhandensein von geeigneten Zuckern wie Glukose.

Pasteur Effekt

Der Pasteur-Effekt beschreibt das Phänomen, dass Hefen unter anaeroben Bedingungen mehr Glukose verbrauchen, als unter aeroben Bedingungen. Dies liegt an der geringen ATP-Ausbeute bei der ethanolischen Gärung.

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Wenn man den Glukoseverbrauch aus dem anaeroben Ansatz mit dem aeroben Ansatz vergleicht, fällt auf, dass der Glukoseverbrauch im belüfteten Ansatz sogar höher ist, als im Unbelüfteten. Wenn man nun den Glukoseverbrauch durch Gärung in beiden Ansätzen vergleicht, zeigt sich, dass die Gärung in beiden Ansätzen ungefähr die gleiche Menge an Glukose umsetzt. ( \(\dot{n}_{Glc}\approx -1,70 \frac{mmol}{g*h} \) ) Das die Hefe im aeroben Ansatz mehr Glukose durch die zusätzliche Atmung umsetzt, zeigt einen negativen Pasteureffekt, was aber auf die aerobe Gärung der speziell gezüchteten Bäckerhefe zurück zu führen ist.

Der respiratorische Quotient (RQ)

\(\left(\frac{\dot{M}_{CO_2}}{\dot{M}_{O_2}}\right) \) ist aufgrund der aeroben Gärung und dem dadurch nur geringen Sauerstoffverbrauch besonders hoch. Die \(CO_2\)-Produktion setzt sich dabei aus Atmung und Gärung zusammen. Aus der Reaktionsgleichung für die vollständige Veratmung von Glukose sieht man, dass der Molfluss von \(O_2\) dem von \( CO_2 \) entspricht. Bei der ethanolischen Gärung ist der Molfluss von \( CO_2 \) doppelt so hoch, wie der von Glukose. Daraus ergibt sich: \[ RQ = \frac{0,549 + 2(1,71)}{0,549} = 7,23 \]

Die ATP-Bildung setzt sich zusammen aus einem Anteil aus der Atmung und einem aus der Gärung. In den theoretischen Vorbetrachtungen ist die jeweilige ATP-Ausbeute aufgeführt. Daraus ergibt sich: \[ \dot{n}_{\text{ATP}} = (91*10^{-3} * 30) + (1,71 * 2) = \mathbf{6,15 \frac{mmol}{g * h}} \]

Ansatz n (Glc) [mmol/(g*h)
anaerob -1,70
aerob -1,80
  ATP [mmol/(g*h)] ATP [%]
Atmung 2,73 44,39
Gärung 3,42 55,61

Für den Menschen hat die aerobe Gärung eine große wirtschaftliche Bedeutung. Die Hefe setzt innerhalb kurzer Zeit große Mengen an Glukose zu \( CO_2 \) um, was als Backtriebmittel eingesetzt wird. Außerdem ist die Vermehrungsrate bei belüfteten Hefesuspensionen höher. Für die Hefe bietet die aerobe Gärung die Möglichkeit schnell große Mengen Glukose zu Intermediaten für den Stoffwechsel bereit zu stellen und der gebildete Alkohol hemmt das Wachstum konkurrierender Mikroorganismen.

Fehlerbetrachtung

Die Versuchsdurchführung bürgt bereits ein hohes Fehlerpotential. So müssen sämtliche Proben innerhalb eines festen Zeitrahmens genommen werden und durch das Wechseln der Versuchsgruppen kann es schnell zu Unklarheiten und Fehlern kommen. Eine weitere Fehlerquelle war das Polarimeter, welches möglicherweise auch defekt war. So klemmte mehrmals die Mechanik vom Zählwerk für die analoge Messwertanzeige. Zusätzlich kann es trotz Spülen zu Verunreinigungen gekommen sein, da das Reinigen der Messkammer nur schwer möglich war.

Sauerstoffverbrauch im Abgeschlossenen System

Durchführung

Es wurde eine verdünnte Hefesuspension und eine Pflanzenzellsuspension hergestellt. Von jeder der Suspensionen wurde eine bestimmte Menge abgenommen und der in dieser Menge enthaltene Sauerstoff unter Luftabschluss und stetigem Rühren mittels eines Rührfisches gleichmäßig in der Suspension verteilt. Der Sauerstoffverbrauch wurde über eine Elektrode, mittels eines Schreibers abhängig von der Zeit visualisiert. Dieser Versuch wurde unter Zugabe von Kaliumcyanid in die Suspensionen wiederholt. Dieses hemmt die Cytochromoxidase, macht also den normalen Atmungsweg unmöglich.

Auswertung

Bei den Pflanzenzellen war der Anstieg des linearen Bereichs im Plot (in mg/l über der Zeit) mit Kaliumcyanid 0,75 mg/l* min. Daraus lässt sich für 8g Planzenzellen auf 300ml (26,667g/l) eine Atmungsrate von 28μg/min*g bestimmen Der Anstieg ohne Kaliumcyanid ist mit 0,6 mg/l*min kleiner und die Atmungsrate beträgt nur 22,5μg/min*g Bei der Hefe mit Kaliumcyanid ist kein linearer Bereich feststellbar (allerdings ging die Sauerstoffkonzentration trotzdem zurück). Ohne Kaliumcyanid ist der Anstieg des linearen Bereichs 0,4mg/l*min, was für eine Hefekonzentration von 1g/l eine Atmungsrate von 400μg/min*g bedeutet. Die Hefesuspension hat also eine bei weitem höhere Atmungsrate als die Pflanzenzellsuspension dies ist durch die Vakuolen der Pflanzenzellen zu erklären Diese sind kaum Stoffwechselaktiv, vergrößern die Zellen aber immens und wirken als Speicherorgan. Dadurch haben wir bei den Pflanzenzellen wenig atmungsaktive sehr große Zellen, während die Hefezellen kleiner sind und keine solche großen beinahe inaktiven Organellen enthalten. Dadurch besitzt eine bestimmte Masse Pflanzenzellen eine viel geringere Stoffwechselaktivität als die selbe Menge Hefezellen. Die Cyanidwirkung ist bei den Pflanzenzellen viel weniger ausgeprägt als bei den Hefezellen, wo fast der ganze Sauerstoffverbrauch zurückging, bei hohen Sauerstoffkonzentrationen wird die Atmungsaktivität sogar noch gesteigert. Dies ist dadurch zu erklären, dass höhere Pflanzen einen Cyanidunempfindlichen alternativen Atmungsweg zur Cytochromoxidase besitzen, der allerdings weniger effektiv bei der ATP Produktion ist als der normale Atmungsweg. Aus diesem Grund hat sich die Atmung nach dem ausschalten der Cytochromoxidase erhöht, um die gleiche Menge ATP zu produzieren. Für den Sauerstoffverbrauch in der mit Kaliumcyanid behandelten Lösung habe ich keine wirkliche Erklärung, auch Fehler in der Versuchsdurchführung scheinen unwahrscheinlich, da die Ergebnisse der anderen Gruppe in diesem Versuch ähnlich waren. An den Kurven ist auch zu erkennen, dass der Lineare Bereich der Kurve unter Kaliumcyanidzugabe zwar steiler ist, aber der lineare Bereich schon bei größeren Sauerstoffkonzentrationen (etwa bei 2,1mg/l) verlassen wird als bei der normalen Atmung (bei etwa 1mg/l). Dies ist damit zu begründen, dass die alternative Oxydase eine geringere Sauerstoffaffinität besitzt, also schon bei höheren Konzentrationen nicht mehr gesättigt ist. Auch ein höherer Km Wert für die alternative Atmung müsste deshalb zu verzeichnen sein.

Sauerstoffverbrauch im Durchflusssystem

Durchführung

Eine Hefesuspension mit einer Konzentration von 10g Hefe pro l wurde gerührt um die Suspension mit Sauerstoff zu sättigen. Danach wurde diese durch einen luftdichten Schlauch gepumpt, an dessen Ende die Sauerstoffkonzentration in der Suspension gemessen. Dieser Versuch wurde mit zwei unterschiedlichen Pumpgeschwindigkeiten durchgeführt. Dadurch konnte aus der Differenz der Konzentrationen und aus der Differenz der Durchlaufzeiten der Sauerstoffverbrauch der Hefezellen bestimmt werden. Außerdem gab es zu jeder Pumpgeschwindigkeit einen Wiederholungsversuch. Die benutzten Pumpgeschwindigkeiten waren 8,4 und 4,2 ml/30s weshalb 2,3 ml eine Zeit von 8,2s und 16,4s benötigten um das Pumpsystem zu durchlaufen. Die gemessenen Sauerstoffkonzentrationen waren 6,3 und 5,3 mg/l bei der schnelleren Pumpgeschwindigkeit und 5,9 sowie 4,9 mg/l bei der langsameren Pumpgeschwindigkeit.

Auswertung

Die mittlere Konzentrationsdifferenz beträgt 0,4 mg/l, die Zeitdifferenz 8,2 s. Es werden also 0,049 mg/l*s verbraucht. Daraus folgt für eine Konzentration von 10g Hefe pro Liter, eine Konzentrationsänderung von 17,56 mgO2*h-1*g-1. Dies entspricht 293μg/min*g es sind also mehr als hundert μg Abweichung zum Experiment mit der verdünnten Suspension zu verzeichnen. Möglicherweise ist dies durch die Stärkere Dichte der Hefezellen und damit auch die stärkere Konkurrenz um Sauerstoff zu erklären. Vielleicht entstehen hierdurch im Schlauch kleine Bereiche mit sehr geringer Sauerstoffkonzentration, so dass hier teilweise die Gärung stärker überwiegt. Andererseits könnten aber auch Fehler im Versuchsaufbau oder der Handhabung der Zellen Gründe für diese Abweichung sein.